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人外周血淋巴细胞分离液分离单个核细胞的方法
点击次数:95 发布时间:2018-10-26
   人外周血淋巴细胞分离液分离单个核细胞的方法
  一、分离外周血中的单个核细胞(PBMC)
  1.抽取正常人静脉血加到肝素抗凝管中,加等量含5-10IU/ml肝素的无血清缓冲液悬浮细胞。将细胞悬液小心加在与血液等量的淋巴细胞分离液上,室温中,水平离心500×g 20分钟。此时离心管中形成5层:最上面是血浆,血浆层和淋巴细胞分离液之间是PBMC,淋巴细胞分离液层和最下面的红细胞层之间是粒细胞层,又成为棕黃层。
  2.吸去最上层的血浆,收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞,尽量全部吸出PBMC。加1-2倍量含5IU/ml肝素、2%灭活小牛血清的Hanks液(洗涤液),混匀后离心200×g 10分钟,低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板,去上清液。
  3.再用同样洗涤液洗涤细胞2次,每次离心500×g 10分钟,洗去残留的淋巴细胞分离液。用1%台盼蓝染色检测细胞活力(应>95%)并计数细胞。再用含10%小牛血清的细胞培养液将细胞配成适当浓度。通常,每毫升外周血可得1×106-2×106PBMC。
  二、分离组织中的单个核细胞
  1.取外科分离的各种组织,用含1%庆大霉素和1%小牛血清的MEM培养液洗涤组织块,洗去可能的污染物。将组织块置培养皿中,加入约为组织块体积5-10倍的同样MEM培养液。用无菌外科剪刀将组织块剪碎成0.5mm3大小。
  2.将组织块转移到小培养瓶中,静置片刻,吸去培养液。加入约2倍组织块体积的、滤过除菌的酶溶液。37℃水浴摇床中消化1-2小时,注意组织块的消化程度。
  3.当组织块消化分散后,用手用力摇晃培养瓶3-5分钟或用大口吸管反复吹打,使细胞团进一步分散。加入30ml上述MEM培养液,终止酶反应。
  4.让上述悬液通过200目的金属网或尼龙网,分离单个细胞。用上述MEM培养液洗涤细胞3次,每次离心1000×g 10分钟。用1%台盼蓝染色法检测细胞活力并计数细胞。
  5.如果细胞量较多(>107),应当用上述淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,并用含10%小牛血清的细胞培养液将细胞配成适当浓度。

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